猫头鹰是典型的肉食性猛禽，食物种类因体型和栖息地而异。小型猫头鹰（如领角鸮）以昆虫、蜥蜴和蛙类为主，中型种类（如长耳鸮）则偏好啮齿类、小型鸟类，而大型猫头鹰（如雕鸮）可捕食野兔、狐狸甚至幼鹿。它们的消化系统适应高蛋白饮食，会反刍无法消化的骨骼和毛发形成食团。人工饲养时需提供全肉饮食，如去骨鸡肉、老鼠或专业猛禽饲料，并补充钙质以维持骨骼健康。

值得注意的是，猫头鹰对食物新鲜度要求极高，变质食物可能导致健康问题。此外，不同品种的食性差异显著，例如谷仓猫头鹰几乎完全以啮齿类为食，而雪鸮在繁殖期会大量捕食旅鼠。