猫头鹰是肉食性猛禽，食谱广泛且具捕食灵活性。其主要食物为啮齿动物，例如田鼠、家鼠等，这类猎物占其饮食的70%以上，对控制农业害虫和鼠类种群具有重要作用。此外，猫头鹰也会捕食昆虫（如蝗虫、甲虫）、两栖动物（蛙类）、爬行动物（蜥蜴、蛇）以及小型鸟类（麻雀、鹌鹑）。部分大型猫头鹰甚至能捕食野兔、松鼠等中型哺乳动物。

捕食方式上，猫头鹰依赖发达的听觉和夜视能力，在夜间从高空俯冲突袭猎物，其锋利的爪子和钩状喙可迅速制服猎物。不同种类的猫头鹰会根据栖息地环境调整食谱，例如森林猫头鹰多捕食鸟类，而草原猫头鹰则以啮齿动物为主。这种食性多样性使其成为生态系统中重要的顶级掠食者。